Navigasi Bagian Hasil
Pembuatan dan pemilihan epitope dilakukan dengan memulai pencarian sequens protein E melalui beberapa sumber, seperti NCBI (https://ncbi.nlm.nih.gov/) dan Uniprot (https://www.uniprot.org/) pada masing-masing serotype dengue (DENV1, DENV2, DENV3, dan DENV4). Sequens dipilih dari tiap serotype, lalu masing-masing dilakukan identifikasi conserved fragments dengan multiple sequence allignment (MSA) dengan multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/) (Corpet, 1988). Hasil pencarian epitope yang didapat serta hasil MSA dapat dilihat di bawah ini:
Hasil Pencarian dan Pemilihan Epitope Protein E
Hasil Multiple Sequence Allignment
Hasil MSA menunjukkan variasi sequence protein E dari tiap serotype berbeda-beda. Oleh karena itu, dipilih strain dengan entri tertentu sebagai backbone utama dengan mempertimbangkan tingkat kemiripannya dari masing-masing sekuens pada tiap serotype. (DENV4: I3RK76, DENV3: 1UZG, DENV2: 1OAN, DENV1: I3RK73). Dari tiap sekuens yang dipilih, ditentukan bagian dari masing-masing sekuens sebagai epitope yang akan dipilih sebagai conserved sequences berdasarkan hasil MSA. Adapun bagian sekuens yang dipilih dari masing-masing serotype dapat dilihat pada tabel di bawah ini:
Prediksi epitope: Masing-masing sekuens dicek afinitasnya terhadap cytotoxic T cell (CTL), helper T cell (HTL), dan B cell lymphocytes (BCL) dengan tools-tools yang ada. Untuk CTL digunakan NetCTL (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetCTL-1.2/) (Larsen et al., 2007), NetMHC (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHC-4.0/) untuk HTL (Andreatta dan Nielsen, 2016), dan ABCPredd (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html) untuk BCL. Untuk CTL, panjang asam amino dipilih 9mer, sedangkan HTL 15mer. Pemilihan alel pada CTL, HTL, dan BCL dilakukan dengan memilih semuanya yang tersedia di website karena bertujuan untuk meningkatkan coverage.
Binding affinity: Seleksi utama didasarkan pada kekuatan ikatan pada MHC 1 dan MHC 2, yang mana strong binding (SB) adalah epitope-epitope yang berada <0,5% dan weak binding (WB) dalam <2%. Epitope-epitope yang berada di luar kriteria langsung dieksklusi karena dianggap tidak berikatan dan dipilih epitope-epitope dalam kategori SB dan WB. Adapun hasil prediksi epitope terhadap MHC 1 dan MHC 2 dapat dilihat pada data di bawah ini:
Tabel-Tabel Prediksi Epitope terhadap MHC 1 dan MHC 2 dari Tiap Serotype
Dari hasil tersebut, dipilih epitope-epitope terbaik berdasarkan kriteria inklusi yaitu antigenistas yang baik, binding dengan MHC 1 dan MHC 2 yang baik, tidak toksik dan tidak bersifat alergen. Adapun epitope terpilih dapat dilihat pada tabel di bawah ini:
Serotype | Sequence Epitope | Allergenicity | Antigenicity | Toxicity |
---|---|---|---|---|
CTL | ||||
DENV4 | AETQHGTTV | Probable Non-Allegen | Antigen | Non-Toxin |
DENV3 | GESNIVIGI | Probable Non-Allegen | Antigen | Non-Toxin |
DENV2 | AETQHGTIV | Probable Non-Allegen | Antigen | Non-Toxin |
DENV1 | AETQHGTVL | Probable Non-Allegen | Antigen | Non-Toxin |
HTL | ||||
DENV4 | STPFAENTNSVTNIE | Probable Non-Allergen | Antigen | Non-Toxin |
DENV3 | KEEPVNIEAEPPFGE | Probable Non-Allergen | Antigen | Non-Toxin |
DENV2 | KIPFEIMDLEKRHVL | Probable Non-Allergen | Antigen | Non-Toxin |
DENV1 | KGMSYVMCTGSFKLE | Probable Non-Allergen | Antigen | Non-Toxin |
BCL | ||||
DENV4 | GDSYIVIGVGDSALTL | Probable Non-Allergen | Antigen | Non-Toxin |
DENV3 | PVNIEAEPPFGESNIV | Probable Non-Allergen | Antigen | Non-Toxin |
DENV2 | HGTIVIRVQYEGDGSP | Probable Non-Allergen | Antigen | Non-Toxin |
DENV1 | PVNIEAEPPFGESYIV | Probable Non-Allergen | Antigen | Non-Toxin |
Epitop-epitop yang telah diciptakan pada tahap sebelumnya dihubungkan menggunakan linker-linker dan adjuvant PADRE sebagaimana telah dijelaskan pada bagian Desain. Hasil penggabungan vaksin dapat dilihat pada diagram di bawah :
https://lh7-rt.googleusercontent.com/docsz/AD_4nXeLBf5mict--RN7hGy948JfZqOcri3QodUc_I0YiYHRV7lxBcgbt5CMYTsPy8c37KaZ726PmES_8gGmmtNNw3tGAtRe2kt-x2spbeQ6u1oUzN3KZi-uweSbXV6qAn-KO6hvfKcq?key=z-jNsZ3nSo9Ult0QGHGbL84u
Sekuens hasil penggabungan dapat dilihat di bawah ini:
EAAAKAKFVAAWTLKAAAGGGSGDSYIVIGVGDSALTLKKPVNIEAEPPFGESNIVKKHGTIVIRVQYEGDGSPKKPVNIEAEPPFGESYIVGGGSSTPFAENTNSVTNIEGPGPGKEEPVNIEAEPPFGEGPGPGKIPFEIMDLEKRHVLGPGPGKGMSYVMCTGSFKLEGGGSAETQHGTTVAYYGESNIVIGIAYYAETQHGTIVAYYAETQHGTVLGGGSAKFVAAWTLKAAAEAAAK
Sekuens antigen multiepitop lalu digabungkan dengan coat protein TMV pada ujung N nya, diagram hasil penggabungan dapat dilihat pada gambar di bawah :
https://lh7-rt.googleusercontent.com/docsz/AD_4nXftUCSOX8lfGJXOdBxqX8i3E8h5xwJJlMPE5wF6bdexu-cEaUzkZahw-7rLmOvNXCjMeuDuA4QZL7mgjWSPoyaF1qu8uFjdXuL3mzPgUHE69o4oPm3A5rAK26s7c_QwTCWvzG5FmA?key=z-jNsZ3nSo9Ult0QGHGbL84u
Sekuens hasil penggabungan dapat dilihat di bawah ini:
MSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELINLCTNALGNQFQTQQARTVVQRQFSEVWKPSPQVTVRFPDSDFKVYRYNAVLDPLVTALLGAFDTRNRIIEVENQANPTTAETLDATRRVDDATVAIRSAINNLIVELIRGTGSYNRSSFESSSGLVWTSGPATEAAAKAKFVAAWTLKAAAGGGSGDSYIVIGVGDSALTLKKPVNIEAEPPFGESNIVKKHGTIVIRVQYEGDGSPKKPVNIEAEPPFGESYIVGGGSSTPFAENTNSVTNIEGPGPGKEEPVNIEAEPPFGEGPGPGKIPFEIMDLEKRHVLGPGPGKGMSYVMCTGSFKLEGGGSAETQHGTTVAYYGESNIVIGIAYYAETQHGTIVAYYAETQHGTVLGGGSAKFVAAWTLKAAAEAAAK
Data optimisasi First round menggunakan GalaxyRefine, data yang memenuhi kriteria diujikan ke MolProbity lalu direfine ulang sebanyak 3 kali hingga didapatkan hasil seperti di website:
vlp4 | ||||||
---|---|---|---|---|---|---|
Model | GDT-HA | RMSD | MolProbity | Clash score | Poorrotamers | Rama favored |
Initial | 1.2000 | 0 | 2.097 | 6.6 | 1.6 | 88.7 |
MODEL 1 | 9.339 | 508 | 1.106 | 3.1 | 0.3 | 98.0 |
MODEL 2 | 9.271 | 504 | 1.139 | 3.5 | 0.0 | 98.0 |
MODEL 3 | 9.308 | 488 | 1.240 | 3.5 | 0.6 | 97.5 |
MODEL 4 | 9.196 | 513 | 1.122 | 3.3 | 0.6 | 98.2 |
MODEL 5 | 9.377 | 474 | 1.139 | 3.5 | 0.6 | 98.0 |
vlp3 | ||||||
Model | GDT-HA | RMSD | MolProbity | Clash score | Poorrotamers | Rama favored |
Initial | 1.2000 | 0 | 1.763 | 3.9 | 0.6 | 88.5 |
MODEL 1 | 9.171 | 535 | 1.091 | 2.1 | 0.3 | 97.5 |
MODEL 2 | 9.214 | 529 | 1.052 | 2.6 | 0.3 | 98.0 |
MODEL 3 | 9.208 | 533 | 1.011 | 2.3 | 1.0 | 98.2 |
MODEL 4 | 9.171 | 528 | 1.089 | 3.0 | 0.3 | 98.0 |
MODEL 5 | 9.171 | 534 | 1.071 | 2.8 | 0.0 | 98.0 |
vlp2 | ||||||
Model | GDT-HA | RMSD | MolProbity | Clash score | Poorrotamers | Rama favored |
Initial | 1.2000 | 0 | 2.135 | 5.1 | 1.9 | 85.2 |
MODEL 1 | 8.940 | 640 | 1.185 | 2.3 | 0.0 | 97.0 |
MODEL 2 | 8.803 | 671 | 1.152 | 2.3 | 0.3 | 97.2 |
MODEL 3 | 8.884 | 647 | 1.129 | 2.1 | 0.3 | 97.2 |
MODEL 4 | 8.915 | 630 | 1.240 | 3.5 | 0.6 | 97.5 |
MODEL 5 | 8.778 | 661 | 1.162 | 3.1 | 0.0 | 97.7 |
vlp1 | ||||||
Model | GDT-HA | RMSD | MolProbity | Clash score | Poorrotamers | Rama favored |
Initial | 1.2000 | 0 | 2.097 | 6.6 | 1.6 | 88.7 |
MODEL 1 | 9.339 | 508 | 1.106 | 3.1 | 0.3 | 98.0 |
MODEL 2 | 9.271 | 504 | 1.139 | 3.5 | 0.0 | 98.0 |
MODEL 3 | 9.308 | 488 | 1.240 | 3.5 | 0.6 | 97.5 |
MODEL 4 | 9.196 | 513 | 1.122 | 3.3 | 0.6 | 98.2 |
MODEL 5 | 9.377 | 474 | 1.139 | 3.5 | 0.6 | 98.0 |
vlp0 | ||||||
Model | GDT-HA | RMSD | MolProbity | Clash score | Poorrotamers | Rama favored |
Initial | 1.2000 | 0 | 1.927 | 3.9 | 1.6 | 88.0 |
MODEL 1 | 8.953 | 589 | 941 | 1.8 | 0.3 | 98.7 |
MODEL 2 | 8.897 | 609 | 941 | 1.8 | 0.0 | 99.0 |
MODEL 3 | 9.002 | 576 | 1.069 | 2.8 | 0.3 | 98.7 |
MODEL 4 | 8.890 | 610 | 988 | 2.1 | 0.0 | 98.5 |
MODEL 5 | 8.940 | 581 | 1.045 | 2.0 | 1.3 | 98.5 |