Phytovac: Immunoinformatics Design of Virus Like Particle-linked Dengue Vaccine for Expression in Nicotiana benthamiana System

Background

Desain

Future Work

Referensi

Navigasi Bagian Hasil

Epitope Generation

Pemilihan dan Pembuatan Epitope

Pembuatan dan pemilihan epitope dilakukan dengan memulai pencarian sequens protein E melalui beberapa sumber, seperti NCBI (https://ncbi.nlm.nih.gov/) dan Uniprot (https://www.uniprot.org/) pada masing-masing serotype dengue (DENV1, DENV2, DENV3, dan DENV4). Sequens dipilih dari tiap serotype, lalu masing-masing dilakukan identifikasi conserved fragments dengan multiple sequence allignment (MSA) dengan multalin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/) (Corpet, 1988). Hasil pencarian epitope yang didapat serta hasil MSA dapat dilihat di bawah ini:

Hasil MSA menunjukkan variasi sequence protein E dari tiap serotype berbeda-beda. Oleh karena itu, dipilih strain dengan entri tertentu sebagai backbone utama dengan mempertimbangkan tingkat kemiripannya dari masing-masing sekuens pada tiap serotype. (DENV4: I3RK76, DENV3: 1UZG, DENV2: 1OAN, DENV1: I3RK73). Dari tiap sekuens yang dipilih, ditentukan bagian dari masing-masing sekuens sebagai epitope yang akan dipilih sebagai conserved sequences berdasarkan hasil MSA. Adapun bagian sekuens yang dipilih dari masing-masing serotype dapat dilihat pada tabel di bawah ini:

Prediksi epitope: Masing-masing sekuens dicek afinitasnya terhadap cytotoxic T cell (CTL), helper T cell (HTL), dan B cell lymphocytes (BCL) dengan tools-tools yang ada. Untuk CTL digunakan NetCTL (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetCTL-1.2/) (Larsen et al., 2007), NetMHC (https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetMHC-4.0/) untuk HTL (Andreatta dan Nielsen, 2016), dan ABCPredd (https://webs.iiitd.edu.in/raghava/abcpred/ABC_submission.html) untuk BCL. Untuk CTL, panjang asam amino dipilih 9mer, sedangkan HTL 15mer. Pemilihan alel pada CTL, HTL, dan BCL dilakukan dengan memilih semuanya yang tersedia di website karena bertujuan untuk meningkatkan coverage.

Binding affinity: Seleksi utama didasarkan pada kekuatan ikatan pada MHC 1 dan MHC 2, yang mana strong binding (SB) adalah epitope-epitope yang berada <0,5% dan weak binding (WB) dalam <2%. Epitope-epitope yang berada di luar kriteria langsung dieksklusi karena dianggap tidak berikatan dan dipilih epitope-epitope dalam kategori SB dan WB. Adapun hasil prediksi epitope terhadap MHC 1 dan MHC 2 dapat dilihat pada data di bawah ini:

Tabel-Tabel Prediksi Epitope terhadap MHC 1 dan MHC 2 dari Tiap Serotype

Dari hasil tersebut, dipilih epitope-epitope terbaik berdasarkan kriteria inklusi yaitu antigenistas yang baik, binding dengan MHC 1 dan MHC 2 yang baik, tidak toksik dan tidak bersifat alergen. Adapun epitope terpilih dapat dilihat pada tabel di bawah ini:

Serotype Sequence Epitope Allergenicity Antigenicity Toxicity
CTL
DENV4 AETQHGTTV Probable Non-Allegen Antigen Non-Toxin
DENV3 GESNIVIGI Probable Non-Allegen Antigen Non-Toxin
DENV2 AETQHGTIV Probable Non-Allegen Antigen Non-Toxin
DENV1 AETQHGTVL Probable Non-Allegen Antigen Non-Toxin
HTL
DENV4 STPFAENTNSVTNIE Probable Non-Allergen Antigen Non-Toxin
DENV3 KEEPVNIEAEPPFGE Probable Non-Allergen Antigen Non-Toxin
DENV2 KIPFEIMDLEKRHVL Probable Non-Allergen Antigen Non-Toxin
DENV1 KGMSYVMCTGSFKLE Probable Non-Allergen Antigen Non-Toxin
BCL
DENV4 GDSYIVIGVGDSALTL Probable Non-Allergen Antigen Non-Toxin
DENV3 PVNIEAEPPFGESNIV Probable Non-Allergen Antigen Non-Toxin
DENV2 HGTIVIRVQYEGDGSP Probable Non-Allergen Antigen Non-Toxin
DENV1 PVNIEAEPPFGESYIV Probable Non-Allergen Antigen Non-Toxin

Vaccine Design

Multiepitope vaccine design

Epitop-epitop yang telah diciptakan pada tahap sebelumnya dihubungkan menggunakan linker-linker dan adjuvant PADRE sebagaimana telah dijelaskan pada bagian Desain. Hasil penggabungan vaksin dapat dilihat pada diagram di bawah :

https://lh7-rt.googleusercontent.com/docsz/AD_4nXeLBf5mict--RN7hGy948JfZqOcri3QodUc_I0YiYHRV7lxBcgbt5CMYTsPy8c37KaZ726PmES_8gGmmtNNw3tGAtRe2kt-x2spbeQ6u1oUzN3KZi-uweSbXV6qAn-KO6hvfKcq?key=z-jNsZ3nSo9Ult0QGHGbL84u

Sekuens hasil penggabungan dapat dilihat di bawah ini:

EAAAKAKFVAAWTLKAAAGGGSGDSYIVIGVGDSALTLKKPVNIEAEPPFGESNIVKKHGTIVIRVQYEGDGSPKKPVNIEAEPPFGESYIVGGGSSTPFAENTNSVTNIEGPGPGKEEPVNIEAEPPFGEGPGPGKIPFEIMDLEKRHVLGPGPGKGMSYVMCTGSFKLEGGGSAETQHGTTVAYYGESNIVIGIAYYAETQHGTIVAYYAETQHGTVLGGGSAKFVAAWTLKAAAEAAAK


VLP multiepitope vaccine design

Sekuens antigen multiepitop lalu digabungkan dengan coat protein TMV pada ujung N nya, diagram hasil penggabungan dapat dilihat pada gambar di bawah :

https://lh7-rt.googleusercontent.com/docsz/AD_4nXftUCSOX8lfGJXOdBxqX8i3E8h5xwJJlMPE5wF6bdexu-cEaUzkZahw-7rLmOvNXCjMeuDuA4QZL7mgjWSPoyaF1qu8uFjdXuL3mzPgUHE69o4oPm3A5rAK26s7c_QwTCWvzG5FmA?key=z-jNsZ3nSo9Ult0QGHGbL84u

Sekuens hasil penggabungan dapat dilihat di bawah ini:

MSYSITTPSQFVFLSSAWADPIELINLCTNALGNQFQTQQARTVVQRQFSEVWKPSPQVTVRFPDSDFKVYRYNAVLDPLVTALLGAFDTRNRIIEVENQANPTTAETLDATRRVDDATVAIRSAINNLIVELIRGTGSYNRSSFESSSGLVWTSGPATEAAAKAKFVAAWTLKAAAGGGSGDSYIVIGVGDSALTLKKPVNIEAEPPFGESNIVKKHGTIVIRVQYEGDGSPKKPVNIEAEPPFGESYIVGGGSSTPFAENTNSVTNIEGPGPGKEEPVNIEAEPPFGEGPGPGKIPFEIMDLEKRHVLGPGPGKGMSYVMCTGSFKLEGGGSAETQHGTTVAYYGESNIVIGIAYYAETQHGTIVAYYAETQHGTVLGGGSAKFVAAWTLKAAAEAAAK


Vaccine Analysis and Refinement

Data optimisasi First round menggunakan GalaxyRefine, data yang memenuhi kriteria diujikan ke MolProbity lalu direfine ulang sebanyak 3 kali hingga didapatkan hasil seperti di website:

vlp4
Model GDT-HA RMSD MolProbity Clash score Poorrotamers Rama favored
Initial 1.2000 0 2.097 6.6 1.6 88.7
MODEL 1 9.339 508 1.106 3.1 0.3 98.0
MODEL 2 9.271 504 1.139 3.5 0.0 98.0
MODEL 3 9.308 488 1.240 3.5 0.6 97.5
MODEL 4 9.196 513 1.122 3.3 0.6 98.2
MODEL 5 9.377 474 1.139 3.5 0.6 98.0
vlp3
Model GDT-HA RMSD MolProbity Clash score Poorrotamers Rama favored
Initial 1.2000 0 1.763 3.9 0.6 88.5
MODEL 1 9.171 535 1.091 2.1 0.3 97.5
MODEL 2 9.214 529 1.052 2.6 0.3 98.0
MODEL 3 9.208 533 1.011 2.3 1.0 98.2
MODEL 4 9.171 528 1.089 3.0 0.3 98.0
MODEL 5 9.171 534 1.071 2.8 0.0 98.0
vlp2
Model GDT-HA RMSD MolProbity Clash score Poorrotamers Rama favored
Initial 1.2000 0 2.135 5.1 1.9 85.2
MODEL 1 8.940 640 1.185 2.3 0.0 97.0
MODEL 2 8.803 671 1.152 2.3 0.3 97.2
MODEL 3 8.884 647 1.129 2.1 0.3 97.2
MODEL 4 8.915 630 1.240 3.5 0.6 97.5
MODEL 5 8.778 661 1.162 3.1 0.0 97.7
vlp1
Model GDT-HA RMSD MolProbity Clash score Poorrotamers Rama favored
Initial 1.2000 0 2.097 6.6 1.6 88.7
MODEL 1 9.339 508 1.106 3.1 0.3 98.0
MODEL 2 9.271 504 1.139 3.5 0.0 98.0
MODEL 3 9.308 488 1.240 3.5 0.6 97.5
MODEL 4 9.196 513 1.122 3.3 0.6 98.2
MODEL 5 9.377 474 1.139 3.5 0.6 98.0
vlp0
Model GDT-HA RMSD MolProbity Clash score Poorrotamers Rama favored
Initial 1.2000 0 1.927 3.9 1.6 88.0
MODEL 1 8.953 589 941 1.8 0.3 98.7
MODEL 2 8.897 609 941 1.8 0.0 99.0
MODEL 3 9.002 576 1.069 2.8 0.3 98.7
MODEL 4 8.890 610 988 2.1 0.0 98.5
MODEL 5 8.940 581 1.045 2.0 1.3 98.5

Prediksi sifat kimiawi vaksin menggunakan ProtParam